Use of the yeast Kluyveromyces marxianus immobilized to produce bioethanol. Recent advances
José Francisco Cortés-Arganda 1, Anna Ilyina1, Cristóbal Noé Aguilar-González 1, Elda Patricia Segura-Ceniceros 1, Georgina Michelena-Álvarez 2,
José Luis Martínez-Hernández 1, Olga Miriam Rutiaga-Quiñones 3, Mónica Lizeth Chávez-González 1, Rodolfo Ramos-González. 4 *
1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Blvd. V. Carranza e Ing. José Cárdenas Valdés, Saltillo, Coahuila 25280, México. *rodolfo.ramos@uadec.edu.mx
2Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar, Vía Blanca 804 y Carretera Central, 11000 San Miguel del Padrón, Ciudad de La Habana, Cuba.
3Instituto Tecnológico de Durango, Blvd. Felipe Pescador 1830 Ote., 34080 Durango, Durango, México.
4CONACYT – Universidad Autónoma de Coahuila, Blvd. V. Carranza e Ing. José Cárdenas Valdés, Saltillo, Coahuila 25280, México.
| Resumen
En el presente documento se realiza un sinopsis sobre la información obtenida atreves de la revisión de literatura sobre la producción de bioetanol a través de Kluyveromyces marxianus describiendo los fundamentos básicos de los diferentes sistemas de producción en sistemas inmovilizados los cual ha sido reportados como uno método más eficiente en cuanto rendimiento y la toleración de compuestos inhibidores de la fermentación y una mayor resistencia a la concentración de etanol y viables de producción de bioetanol a partir de materiales lignocelulósicos. Se describe el uso de diversas matrices de inmovilización con diferentes variables de proceso para obtener las condiciones que optimicen la producción de bioetanol. Se destaca el uso de Kluyveromyces marxianus inmovilizada en diferentes soportes, lo que mejorar las propiedades de esta levadura para ser utilizada en la producción de bioetanol. Palabras clave: Kluyveromyces marxianus; inmovilización; bioetanol. |
| Abstract
This review summarizes the information obtained through the literature on the production of bioethanol through Kluyveromyces marxianus. Describes the fundamentals of the different production systems in immobilized systems which have reported as a more efficient method regarding yield and tolerance of fermentation inhibitor compounds and increased resistance to ethanol concentration and viable production of bioethanol from lignocellulosic materials. The use of different immobilization matrices with different process variables is described to obtain the conditions that optimize bioethanol production. It stands out the use of Kluyveromyces marxianus immobilized in different supports, which improve the properties of this yeast to applied in the production of bioethanol. Keywords: Kluyveromyces marxianus; Immobilization; Bioethanol. |
Introducción
Las levaduras son ampliamente utilizadas en procesos biotecnológicos para la producción de alimentos, bebidas, enzimas y fármacos. Levaduras de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Debarromyces y Yarrowia tienen poseen un rol importante en el campo de la biotecnología, siendo de las más estudiadas y aplicadas en esta área. Sin embargo, debido al constante desarrollo del sector biotecnológico, es que existe un creciente interés en la utilización de las llamadas levaduras “no convencionales”. Una de esas levaduras es Kluyveromyces marxianus (Lane y Morrissey, 2010), y es sobre la cual trata este artículo de revisión.
Kluyveromyces marxianus, también reportada en la literatura como K. fragilis y Saccharomyces keyfr, fue descrita por primera vez en 1888, y fue nombrada como Kluyveromyces marxianus. Esta levadura es descrita como microorganismo homotálico y hemiascomiceto, es relacionada filogenéticamente con Saccharomyces cerevisiae y es una especie hermana de Kluyveromyces lactis(Fonseca y col., 2008). K. marxianus, a diferencia de sus especies hermanas, ha sido adoptada ampliamente por la industria, principalmente porque posee características que la hacen deseable para aplicaciones biotecnológicas (Pentjuss y col., 2017). Estas incluyen la capacidad de asimilar azúcares como la inulina y la lactosa, también el rápido grado de crecimiento, así como su termo-tolerancia con la habilidad de crecer a temperaturas de hasta 50 °C y su elevada capacidad secretora (Charoensopharat y col., 2015; Gao y col., 2015; Hong y col., 2015; Moreira y col., 2015; Srivastava y col., 2016; Saini y col., 2017).
La levadura Kluyveromyces marxianus es de importancia industrial y biotecnológica debido a su capacidad de producir las enzimas b-galactosidasa e inulinasa, que permiten el uso de lactosa e inulina como fuentes de carbón (Silva y col., 2013; Tokošová y col., 2016). La asimilación de lactosa es posible que se lleve a cabo por K. marxianus gracias a que produce lactosa permeasa y b-galactosidasa (Fonseca y col., 2008). Así mismo, ha despertado interés en la industria biotecnológica debido a que esta levadura posee la capacidad de crecer y reproducirse a temperaturas de hasta 44 °C aproximadamente, pero se han reportado estudios en los que se detalla su termo-tolerancia por encima de los 50 °C (Raimondi y col., 2013). Esta propiedad es de suma importancia industrial, pues permite realizar fermentaciones a altas temperaturas, lo que reduce los costos para enfriamiento además de que se puede prevenir el crecimiento de microorganismos contaminantes. Por otro lado, K. marxianus se caracteriza por poseer un elevado grado de crecimiento, lo que reduce los tiempos de propagación de la levadura para ser usada industrialmente (Wilkowska y col., 2015). Otra característica importante de esta levadura, que la hace útil para aplicaciones industriales y biotecnológicas, es su capacidad de generar energía ya sea mediante respiración o fermentación, ya que es un microorganismo respiro-fermentativo. Gracias a esta característica es que se ha venido utilizando a K. marxianus para la producción de etanol en la industria de los biocombustibles (Morrissey y col., 2015).
El desarrollo de tecnologías que permitan inmovilizar células microbianas, organelos y enzimas se ha acrecentado en la actualidad debido a la gran variedad de aplicaciones científicas y tecnológicas que se les puede dar a estos productos (Krasnan y col., 2016). En particular, una célula inmovilizada es una célula viva (bacteria, hongo o levadura) a la cual se le limita el movimiento de su locación original por medio de medios naturales o artificiales (Vojtisek y Jirku, 1983). La inmovilización celular puede ser definida como la ubicación física de células en un espacio o región específica, de forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una actividad catalítica de interés (Elnashar, 2010). Y dicha inmovilización tiene por objetivo el mejoramiento de la productividad y la reutilización de la biomasa en diferentes ciclos de la reacción (Groboillot y col., 1994). Los cinco principales métodos de inmovilización de células y enzimas son absorción, enlace covalente, atrapamiento, encapsulación, y entrecruzamiento (Brena y col., 2013; Karav y col., 2017; Polakovič y col., 2017). Una de las mayores ventajas de la inmovilización es la estabilidad catalítica que puede ser mayor para células inmovilizadas que para células libres y algunos microorganismos inmovilizados toleran concentraciones más altas de compuestos tóxicos que su contraparte no inmovilizadas (Jack y Zajic, 1977; Eş y col., 2015). En la actualidad la inmovilización de levaduras es unas de las metodologías más estudiadas para la producción de bioetanol a partir de biomas lignocelulósicas donde se han desarrollado diferentes estrategias para obtención de altos rendimientos en procesos de sacarificación y fermentación simultánea, biorreactores, co-cultivo (Borovikova y col., 2014; Mohd Azhar y col., 2017).
Inmovilización de Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus, levadura de grado GRASS (Raimondi y col., 2013) que ha sido ampliamente utilizada en un sinfín de procesos biotecnológicos para la obtención de enzimas (inulinasa, β-galactosidasa, β-glucosidasa, β-xilosidasa, endopoligalacturonasa, proteínas fosfatasas, carboxipeptidasa, aminopeptidasa) (Kushi y col., 2000; Bansal y col., 2008; Piemolini-Barreto y col., 2015), para la producción de proteína celular, bioadsorción de metales pesados, producción de compuestos aromáticos (ésteres frutales, ácidos carboxílicos, acetona, furanos, 2-feniletanol) (Fabre y col., 1998; Pal y col., 2009) pudiendo ser inmovilizada en un gran número de soportes sintéticos (perlas de alginato de calcio) y soportes naturales (bagazo, trozo de hoja de vaina de plátano, trozos de manzana) (Subhashini y col., 2013; Roohina y col., 2016) además en años recientes ha surgido el interés de inmovilizar la levadura en soporte nanoestructurados y micro nanopartículas magnéticas (Liu y col., 2009).
Diversos trabajos han reportado el uso de Kluyveromyces marxianus inmovilizada. Por ejemplo, Bajpai y Margaritis (1985) la inmovilizaron en perlas de alginato de calcio para la producción de bioetanol utilizando Helianthus tuberosus como única fuente de carbono con el fin aumentar la estabilidad de la actividad inulinasa tratada con agentes endurecedores donde se demostró que las células no inmovilizadas mantenían su actividad de 25-35, sin embargo descendía abruptamente cuando se estaba por encima de los 35°C, en cambio los rendimientos de las células inmovilizadas se mantenían, incluso en rangos de temperatura de 25-45° C. Por otro lado, Roohina y col. (2016) utilizaron células de K. marxianus inmovilizadas en carboximetilcelulosa (CMC) para la producción de etanol a partir de suero de leche. Du Le y col. (2013) evaluaron la estabilidad térmica de Kluyveromyces marxianus inmovilizada en piezas de vaina de la hoja de plátano. Se observó que la levadura inmovilizada tuvo mayor asimilación de glucosa y mayor producción de etanol que la levadura libre. En la Tabla 1 se muestran algunos trabajos en los que se inmovilizó Kluyveromyces marxianus en diferentes soportes para su posterior aplicación biotecnológica.
Tabla 1. Inmovilización de Kluyveromyces marxianus sobre diversos soportes para aplicaciones biotecnológicas.
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Microorganismo |
Soporte |
Objetivo |
Referencia |
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Kluyveromyces marxianusUCD(FST)55-82 |
Perlas de alginato de calcio |
Aumentar la estabilidad de inulinasa inmovilizada tratada con agentes endurecedores. |
(Bajpai y Margaritis, 1985) |
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Kluyveromyces marxianusCDBB-L-278 |
Perlas de alginato de bario |
Diseñar y caracterizar un sistema de células de K. marxianus con actividad inulinásica inmovilizada. |
(Barranco-Florido y col., 2001) |
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Kluyveromyces marxianus IBM3 |
Material celulósico deslignificado |
Mejorar el aroma y el sabor del suero de leche, para ser utilizado como materia prima para una nueva bebida de bajo contenido de alcohol. |
(Kourkoutas et al. 2002) |
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Kluyveromyces marxianus IBM3 |
Trozos de manzana |
Estudiar la inmovilización de K. marxianus sobre piezas de manzana para la elaboración de vino. |
(Kourkoutas, Kanellaki, y Koutinas 2006) |
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Kluyveromyces marxianus DSMZ 7239 |
Perlas de aliginato de calcio |
Convertir suero orgánico en bioethanol por fermentación con K. marxianus. |
(Christensen et al. 2011) |
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Kluyveromyces marxianus |
Alginato de calcio |
Bioconversión de suero de leche en etanol. |
(Gabardo y col., 2014) |
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K. marxianus BCRC 21363 |
Arreglos de microtubos de poliácido láctico |
Producción de bioetanol |
(Chen y col., 2015) |
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Kluyveromyces marxianus PTCC 5194 |
Carboximetilcelulosa (CMC) y copolímero de CMC con N-vinil-2-pirrolidona |
Obtención de etanol a partir de suero de queso |
(Roohina y col., 2016) |
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β-galactosidasa y K. marxianus |
Hidrogel de alcohol polivinílico (PVA) |
Producción de galacto-oligosacáridos (GOS) |
(Tokošová y col., 2016) |
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K. marxianus MTCC 4136 y S. cerevisiae MTCC 170 |
Alginato de calcio |
Obtención de bioetanol |
(Beniwal y col., 2018) |
Producción de bioetanol a partir de Kluyveromyces marxianus inmovilizado
Una de las técnicas más utilizadas para mejorar los procesos de obtención de bioetanol es la inmovilización de levaduras que sean capaces de producir etanol a bajo costo. El género Kluyveromyces ha sido reportado como una levadura capaz de producir etanol por encima de los 40 °C y tiene su máximo crecimiento a una temperatura de 49 °C, incluso hasta de 52 °C (Nonklang y col., 2008; Diniz y col., 2017), y de acuerdo con los criterios de Banat y col. (1998) podrían ser categorizadas como levaduras termófilas.
A lo largo de la historia Saccharomyces cerevisiae ha sido considerada como la mejor opción para la producción de bioetanol a escala industrial. Sin embargo, el crecimiento de S. cerevisiae se reduce significativamente cuando de utilizan altas temperaturas incluso a 35 °C (Du Le y col., 2013). Una opción es la utilización de cepas termo-tolerantes como Kluyveromyces marxianus por tener la capacidad de asimilar los azúcares y producir etanol a temperaturas de 40 a 45 °C (Bajpai y Margaritis, 1985). Kluyveromyces marxianus es capaz de metabolizar glucosa, xilosa, inulina, galactosa y lactosa, por lo tanto, posee un potencial útil para asimilar una amplia variedad de sustratos a elevadas temperaturas (Rocha y col., 2010; Hong y col., 2015; Roohina y col., 2016; Mohd Azhar y col., 2017; Saini y col., 2017). Han sido muchas las investigaciones con respecto a la obtención de bioetanol a partir de residuos agroindustriales como suero de leche, así como también diferentes materias primas lignocelulósicas que son residuos de los sectores agrícola, forestal y agroindustrial (Tabla 2).
Tabla 2. Obtención de bioetanol a partir de residuos agroindustriales fermentados por Kluyveromyces marxianus.
| Microorganismo | Tipo de fermentación | Sustrato | Temperatura | Rendimiento etanol (g/l) | Rendimiento teórico | Referencia |
| Kluyveromyces marxianus SUB-80-S | Baño en frasco Erlenmeyer | D-xilosa | 35 °C | 0.28 g EtOH/g D-xilosa | 55 % | (Margaritis y Bajpai 1982) |
| Kluyveromyces marxianus var. ATCC 12708 | Baño en frasco Erlenmeyer | Cascaras de naranja hidorlizadas | 37 °C | 37.1 g/l (72 Hrs) | 88 % | (Wilkins et al. 2007) |
| Kluyveromyces marxianus DMKU 3-1042 | Baño en frasco Erlenmeyer | Jugo de caña de azúcar | 37 °C | 6.78% (w/v) | — | (Limtong, Sringiew, y Yongmanitchai 2007) |
| Kluyveromyces marxianus TY-3 | Baño; células inmovilizadas en perlas de aliginato de calcio | Polvo de suero de leche | 30 °C | 0.68 | 63 % | (Guo, Zhou, y Xiao 2010) |
| Kluyveromyces marxianusCE025 | Baño | Bagaso de manzana | 30 °C | 0.417 | — | (Rocha et al. 2011) |
| K. marxianus PT-1 (CGMCC AS2.4515) y S. cerevisiae JZ1C (CGMCC AS2.3878) | Baño en frasco Erlenmeyer | Helianthus tuberosus | 30 – 40 °C | De 65.2 a 73.6 gL-1 | De 79.7 a 90.0 % | (Hu y col., 2012) |
| K. marxianus, cepas: CBS 6556; CCT 4086; var. lactis CCT 2653; UFMG 95 302.2; UFMG 95 205.3 y UFMG 95 270.1 | Biorreactor continuo; levaduras inmovilizadas en perlas de aliginato de calcio | Suero | 30 °C | De 0.51 a 70 gL-1 | — | (Gabardo y col., 2014) |
Conclusiones
Se puede concluir que la levadura Kluyveromyces marxianus es un fuerte competidor (de levaduras tradicionales) para la producción de bioetanol. Presentando, en muchos casos, propiedades superiores a la hora de ser utilizada en procesos de fermentación de diferentes sustratos provenientes de residuos de la agroindustria. La inmovilización de células de levaduras es área que se ha venido desarrollando en los últimos años, mediante la utilización de soportes naturales, que les confieren a las células la capacidad de reúso, de proveerles estabilidad a condiciones de pH y temperatura, así como también de protección contra inhibidores. La aplicación de Kluyveromyces marxianus inmovilizada permite mejorar aún más las propiedades de esta levadura para ser utilizada en la producción de bioetanol.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el financiamiento para llevar a cabo este trabajo de investigación. Así como también por el apoyo otorgado bajo el programa de Cátedras CONACYT–2015 (Proyecto No. 729). Así mismo, J. F. Cortés-Arganda agradece a CONACYT por la beca de posgrado otorgada.
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