Production of Trichoderma harzianum Enzymes by Fermentation of Lignocellulosic Residues

Gómez-García, R.1, Roussos, S.3, Medina-Morales, M. A.1, Farruggia, B.2, Pico, G.2 and Aguilar, C. N.1*
1Grupo de Investigación en Bioprocesos y Bioproductos. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Saltillo, Coahuila, México.
2Institut Méditerranéen d’Écologie et de Paléoécologie (IMEP, UMR CNRS/IRD 6116), Laboratoire d’Ecologie Microbianne et Biotechnologies, FST St Jerome, Université Paul Cazanne, 13397 Marseille Cadex 20, France
3Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos (IPROBYQ-CONICET). National University of Rosario Argentinaa
*Autor para correspondencia: cristobal.aguilar@uadec.edu.mx +52 1 844 416 12 38

JBCT No. 22, Vol. 11 julio-diciembre 2019
Artículo PDF

  Resumen   El uso de residuos agroindustriales como substratos sólidos para el crecimiento fúngico en el bioproceso llamado Fermentación en Medio Sólido (FMS) juega un papel importante en diversas áreas como el medio ambiente y la alimentación. Esta importancia se ha incrementado en las últimas décadas en el ámbito de la investigación referente a la bioconversión y valorización de subproductos agroindustriales lignocelulósicos. El género Trichoderma contiene especies que son de gran importancia biotecnológica. Algunas de ellas son usadas como agentes de biocontrol contra enfermedades de plantas, otras en la biorremediación de ambientes contaminados, además se ha aplicado en procesos de FMS para la bioconversión de residuos agroindustriales para la producción de biomoléculas con alto valor como; enzimas lignocelulolíticas, entre otros bioproductos. Actualmente, las enzimas fúngicas presentan diferentes ventajas contra las enzimas de origen animal y vegetal relacionadas con altos títulos de producción y alta estabilidad, mayor actividad catalítica y mayor afinidad al sustrato. En este trabajo se analizan y discuten los avances y los retos de la bioconversión de la materia lignocelulósica a través de la aplicación del hongo Trichoderma harzianum por su capacidad de producción de enzimas así como su potencial aplicación en industrias alimentarias, textiles y biorefinerias.     Palabras clave: Bioconversión, enzimas, residuo lignocelulósico, Trichoderma
  Abstract   The use of agroindustrial residues as solid substrates for fungal growth in the bioprocess called Solid-State Fermentation (SSF) plays an important role in various areas such as the environment, food, feed and industrial sectors. This importance has increased in recent decades in the research field concerning the bioconversion and valorization of lignocellulosic agro-industrial by-products. The genus Trichoderma contains species that are of great importance biotechnology; some of them are used as biocontrol agents against plant diseases, as bioremediation of contaminated environments, also in recent years has increased their application in SSF process for bioconversion of residual material in order to produce value-added biomolecules such as: lignocellulolytic enzymes, among other bioproducts. Currently, fungi enzymes present different advantages against animal and plant origin enzymes related with high values of production and high stability, major catalytic activity and substrate affinity. This review analyzes and discusses the progress and challenges of the bioconversion of lignocellulosic material with the fungus Trichoderma harzianum due its high capacity to produce lignocellulosic enzymes as well as their potential application in food, textile and biorefinery industries.   . Keywords: Bioconversion, enzymes, lignocellulosic material, Trichoderma

INTRODUCCIÓN

Los desechos lignocelulósicos incluyen residuos de la industria forestal y de la agronomía, dichos residuos son las más prometedoras alternativas de fuentes de energía y puede ser utilizados como material de bajo costo para la obtención de productos con alto valor comercial e industrial1. Estos materiales lignocelulósicos están constituidos principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, son abundantemente disponibles además de ser materiales renovables encontrados en la naturalez2. Con el incremento de la demanda energética y la preocupación sobre la contaminación continua del medio ambiente, el desarrollo de metodologías o procesos que ayuden a la obtención de fuentes de energías alternativas y disminuyan la contaminación ambiental ha sido objeto de estudio en la última década3. La bioconversión de biomasa lignocelulósica promete ser un proceso adecuado capaz de contrarrestar los problemas energéticos y de contaminación presente en la actualidad, esto debido a su gran disponibilidad y su poco o nulo costo de adquisición, además durante el proceso no hay emisiones nocivas a la salud humana y es amigable con el medio ambiente. Por otro lado, dicho proceso puede ser aprovechado para la obtención y producción de moléculas con alto peso molecular de gran valor comercial, la bioconversión de materia lignocelulósica y la producción de biomoléculas se ha llevado a cabo mediante fermentación acoplada en cultivo continuo4. La FMS es una técnica biotecnológica simple para el cultivo microbiano y la producción de metabolitos.  Tiene la ventaja de no requerir equipos complejos, lo que da como resultado menores costos de producción5,6,7. La FMS ha sido definida por diferentes autores como un proceso microbiano o cultivo que se desarrolla no sólo en la superficie sino también dentro de una matriz porosa sólida y en ausencia de líquido libre8,9. La matriz porosa puede estar constituida del sustrato húmedo o un soporte inerte capaz de absorber los nutrientes que se disuelven en la solución10. Dependiendo de la naturaleza de la fase sólida, hay dos tipos de fermentación: a) Medio de cultivo impregnado sobre un soporte inertey b) Cultivo en una fase sólida substrato/soporte. Los bioprocesos microbianos en residuos orgánicos han demostrado ser una herramienta potencial para la reducción de contaminación en el medio ambiente y en la obtención de productos con valor agregado. En la actualidad se conocen varios grupos de microorganismos los cuales son utilizados en la biotransformación de los residuos a nuevos productos. Aspergillus spp es conocida por producir ácidos orgánicos tales como ácidos cítrico y láctico a partir de cascaras cítricas, Bacillus sp esta cepa es utilizada para la producción de enzimas como celulasas, amilasas y proteasas11,12 y T. harzianum se ha reportado su aplicación para la producción de metabolitos secundarios como aromas y en la producción de enzimas lignocelulolíticas.

DESCRIPCIÓN DEL GÉNERO Trichoderma

El género Trichoderma se ubica taxonómicamente dentro del reino fungí, división Mycota, subdivisión Eumycota, clase Deuteromicetes, orden Moniales, familia Moniliacea, género Trichoderma. Morfológicamente, es un hongo que posee conidias hialinas uniceluladas. Los conidios son erectos, hialinos en su mayoría ramificada, no verticilada los que pueden ser solitarios o en grupo13. Las fialidades en forma de botella hinchadas de la región central pero delgadas hacia el ápice, son hialinas y en ángulos rectos hacia los conidióforos, tiene la capacidad de producir clamidosporas en sustratos naturales, estructuras de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo bajo condiciones adversas14 . Trichoderma es un hongo aerobio, facultativo que se encuentra de manera natural en un número importante de suelos de todas las zonas climáticas del mundo (suelos agrícolas, pastizales, bosques, desiertos y ecosistemas acuáticos)15, también se ha encontrado sobre la superficie de la raíces de las plantas y sobre cortezas en descomposición. Algunas especies de Trichoderma son ampliamente utilizadas como agentes de control biológico, en la agricultura contra varios hongos fitopatógenos y nematodos, otras para la producción de enzimas con interés industrial como celulasas, pectinasas, quitinasas, proteasas, xilanasa16,17,18.

CARACTERÍSTICAS COMUNES T. harzianum

Las especies pertenecientes al género Trichoderma se caracterizan por ser hongos saprófitos, que sobreviven en suelos con diferentes cantidades de materia orgánica, que son capaces de degradar para aprovecharlo como sustrato y potenciar su desarrollo. Hay una peculiaridad del género Trichoderma la cual es su crecimiento y esporulación rápida en la oscuridad. Son hongos mesófilos tolerantes a baja temperatura (10 °C), pero el micelio es muy sensible a temperaturas superiores a 30 °C. Algunos microorganismos han sido reportados como xilanolíticos, la mayoría de las bacterias, hongos y levaduras que producen dicha enzima lo hacen extracelularmente. La capacidad de diferentes variedades de Trichoderma spp. de producir xilanasas, ha sido reportada, así como su aplicación en la industria alimentaria, textil, biorefineria y otras14. El uso de la xilanasa para la hidrolisis de material lignocelulósico está bajo estudio extenso debido a la producción de xilosa, el cual puede ser usado como materia prima de fermentación en la producción de ácido xilónico, xilitol y bioetanol19. También existe interés en el uso de xilanasas en el bioblanqueo de pastas de celulosa, lo que disminuye la demanda de átomos de cloro en el blanqueo convencional  en la fabricación de papel20. Entre las especies de Trichoderma más ampliamente empleados destacan Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma sperellum y Trichoderma. harzianum. Este género se le puede encontrar en diferentes materiales orgánicos y suelos, están adaptados a diferentes condiciones ambientales lo que facilita su amplia distribución. Algunas especies prefieren ambientes secos y templados. Estos hongos son ampliamente conocidos por su producción de toxinas y antibióticos21. En el estadio temprano de T. harzianum, el color del micelio es blanco y eventualmente desarrolla un color verde oscuro después de la esporulación (figura 1). Las colonias de T. harzianum crecen y maduran rápidamente a los cinco días de incubación en medio de cultivo agar papa y dextrosa (PDA) a una temperatura de 25 °C. Las especies de este género generalmente prefieren un pH ácido que oscila entre 4.5 – 5, además se desarrolla en áreas como un excesivo contenido de humedad y un estancamiento de bióxido de carbono (CO2) en la atmósfera además, T. harzianum puede crecer de buena forma sobre aminoácidos, amoniaco, urea y nitrato. Un mejor crecimiento de T. harzianum se observa en presencia de azucares como; D-manosa, D-galactosa, D-xilosa, sacarosa y manitol22. El crecimiento de Trichoderma y particularmente T. harzianum se caracteriza por cuatro etapas fisiológicas10,23;la conservación, germinación de conidias, multiplicación vegetativa del micelio y conidiogénesis. Las conidiosporas son el medio de conservación del microrganismo a largo plazo, las cuales son empleadas como inoculo de FMS. La germinación de T. harzianum en azúcares simples comienza después de 9 horas de cultivo y termina después de 14 horas. Después de este período, todos las conidiosporas presentan un tubo germinativo de longitud variable, pero mayor que el diámetro de la espora. El micelio se desarrolla y presenta muchas ramificaciones. Esta fase conduce a una alta producción de biomasa. La conidiogénisis es una etapa fisiológica muy importante para los hongos. Esta etapa corresponde a una formación y liberación de esporas las cuales son muy resistentes y forman parte de la reproducción asexual de los microorganismos. Se conoce que la liberación de esporas se induce mediante la limitación de nutrientes del medio de cultivo. La naturaleza de este factor es muy variable, el agotamiento de fuente de carbono y nitrógeno es generalmente un factor limitante para la producción de esporas. Además existen otros factores fisicoquímicos que pueden dar paso a la conidiogénesis tales como el pH, concentración de dióxido de carbono, oxigeno, temperatura, humedad y/o la aparición de metabolitos secundarios24.

Figura 1. Morfología macroscópica de T. harzianum en Papa Dextrosa Agar a 37 ºC

ENZIMAS

Xilanasas

Las enzimas xilanasas (EC3.2.1.8) son extensamente distribuidas, se produce tanto en organismos procariotas y eucariotas y se ha encontrado mayormente en eucariotas incluyendo, protozoos, insectos, caracoles y en semillas germinadas de plantas25. Pertenece al grupo de las enzimas hemicelulolíticas las cuales tienen el poder catalítico para degradar la cadena polimérica de hemicelulosa hidrolizando los enlaces b-1,4-xilanos presentes en la cadena homo-polimérica de xilano (figura 2). Este grupo de enzimas juegan un papel importante en la bioconversión de dicho polímero debido a su gran y compleja estructura. Las xilanasas, se definen y clasifican de acuerdo sobre el substrato en el que actúan. Se agrupan colectivamente como glucano hidrolasas. L-arabinasas degradan solo L-arabino-D-galactan, manosas hidrolizan enlaces b-(1,4)-D-manopironosa de manano y b-xilanasas rompen los enlaces b-(1,4)-D-xilopiranosil de xilano26.  Existen tres diferentes tipos de xilanasas involucradas en la degradación del xilano.

Endo-β-(1,4)-D-Xilanasa [β-(1-4)-D-Xilan Xilano Hidrolasa, EC 3.2.1.8]

Esta enzima actúa aleatoriamente sobre la cadena de xilano para producir grandes cantidades de xilo-oligosacaridos de cadenas de diferentes tamaños 23,27,28.

Hay cuatro tipos:

  1. Endoxilansas no Liberadoras de Arabinosa, las cuales no pueden actuar sobre los enlaces iniciales b-(1,4) de L-arabinosil en la ramificación y produce solo xilobiosa y xilosa como el producto final mayoritario. Estas enzimas pueden hidrolizar los xilo-oligosacaridos en monómeros de xilobiosa.
  2. Endoxilanasas no Liberadoras de Arabinosa, estas enzimas no pueden romper la ramificación en los puntos a-(1,2) y a-(1,3) y produce principalmente xilo-oligosacaridos más largos que la xilobiosa. Estas endoxilanasas no tiene mecanismo de acción sobre xilotriosa y xilobiosa.
  3. Endoxilanasas Liberadoras de Arabinosa. Estas enzimas rompen las cadenas de xilano en los puntos de ramificación y produce principalmente, xilobiosa, xilosa y arabinosa.

Endoxilanas Liberadoras de Arabinosa, estas pueden hidrolizar los puntos de ramificación y producir xilo-oligosacáridos de tamaño intermedio y arabinosa.

Exo-b–-(1,4)-D-xilansa [b-(1,4)-D-Xilan Xilohidrolasa]     

Estas enzimas hidrolizan los xilo-oligosacaridos liberados por acción de la Endo-b-(1,4)-D-xilanasa, desde el extremo no reductor de la cadena dando como producto xilobiosa, algunos autores reporta la inactivación de esta enzima tras la acumulación de dicho disacárido el cual solo puede ser hidrolizado la enzima b-xilosidasa29.

b-Xilosidasa o Xilobiasa: (EC 3.2.1.37)

Los disacáridos formados son degradados a xilosa por la acción de esta enzima, la cual remueve las unidades de xilosa del extremo no reductor de los xilo-oligosacáridos30. Los grupos laterales restringen la acción de las b-xilosidasas, y por lo tanto sólo los oligosacáridos no sustituidos se degradan totalmente. Se dice que algunas b-xilosidasas actúan también sobre xilano polimérico29.

Figura 2. Estructura química del xilano

Celulasas

Las celulasas son una mezcla de tres enzimas hidrolasas, las cuales actúan sobre las cadenas poliméricas de celulosa (figura 3), rompiendo los enlaces b-1,4 glucosídicos presentes en la celulosa31. La celulosa es el polisacárido más abundante en la naturaleza que cubre las dos terceras partes de la biomasa lignocelulósica y puede ser hidrolizada en azucares como glucosa, hexosas y pentosas para la producción de biocombustibles32. La hidrolisis de este polisacárido se ha llevado a cabo por métodos químicos y físicos, haciendo estos procesos tardados y costos, además de impactar negativamente al medio ambiente33.

El desarrollo de procesos biotecnológicos para llevar a cabo dicha bioconversión en monómeros simples de glucosa es de suma importancia, en la cual refiere en la producción y  el uso de enzimas lignocelulolíticas34.

Para acceder a estas fracciones celulósicas se requiere una hidrólisis sucesiva de tres enzimas35:

  1. Endo-b-1,4 glucanasa = Carboximetil celulosa (ACMC) o No. 3.2.1.4 (EG: Cx)
  2. Exo-b-1,4 glucanasa = Celobiohidrolasa o No. 3.2.1.91 (CBH: C1)
  3. b-glucosidasa o Celobiasa No. 3.2.1.21

La definición más simple de celulasa consiste en un complejo polienzimático que atacan la celulosa y la trasforme en sacarosas simples capaces de atravesar la pared celular36. De acuerdo con esta definición, el sistema enzimático completa sólo existe en relativamente pocos microorganismos; el más conocido entre los hongos filamentosos son Aspergillus, Chaetomium y Trichoderma37. El mecanismo de acción de este complejo se efectúa con la hidrolisis primaria de la celulosa microcristalina creando rupturas en las cadenas del polímero llevada a cabo por la Endo-b-1,4 glucanasa, seguida por la acción de Exo-b-1,4 glucanasa la cual ataca los puntos de ruptura desde los extremos de la celulosa produciendo tetrasacáridos o disacáridos como la celobiosa 38.  La acción continúa y combinada de la de ambas enzimas permiten la conversión completa de la celulosa en celobiosa y pequeños oligosacáridos. Finalmente, la enzima b-glucosidasa actúa sobre la celobiosa y oligosacáridos para liberar el monómero de glucosa23.

Figura 3. Estructura química del polímero de celulosa

RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS

Diversos investigadores de todo el mundo han reportado el aprovechamiento de material vegetal de industrias principalmente alimentarias, las cuales deshecha toneladas de este material el cual es considerado un residuo sin valor alguno y sin alguna aplicación relevante. En un estudio reciente fue reportado el aprovechamiento de material residual proveniente de frutas y verduras para la producción de ácidos orgánicos y enzimas lignocelulolíticas39. Adicionalmente, en el cuadro 1 se muestran una recopilación de datos en la aplicación de materiales residuales más empleados, así como los principales productos obtenidos por FMS. Estas evidencias científicas demuestran la aplicabilidad de esta materia prima como fuente natural para la obtención de bioproductos con alto valor e importancia industrial.

Tabla 1. Aplicaciones de residuos lignocelulósicos para la obtención de productos con alto valor agregado por fermentación.

Trichoderma harzianum desarrolla un papel fundamental en el aprovechamiento de material lignocelulósico residual debido a la gran facilidad con la que crece sobre el material, asimilando como fuente de carbono los componentes estructurales presentes, principalmente celulosa y hemicelulosa. La bioconversión por fuentes microbianas de estos compuestos presentes en la naturaleza ha sido el tema principal de investigación en diversos grupos del mundo ya que la obtención de estos materiales lignocelulósicos no representa problema alguno además su costo es muy bajo o casi nulo y con el aprovechamiento de este tipo de material para el crecimiento microbiano y con la ayuda de metodologías fermentativas es posible la producción de moléculas con gran valor industrial, haciendo este proceso de muy alta rentabilidad, disminuyendo los tiempos de producción y el costo del mismo. Debido a la complejidad de la estructura hetero-polimérica de la celulosa y el reto que representa su degradación en moléculas monoméricas, se han desarrollado metodologías en la búsqueda de enzimas con capacidad de hidrolizar este polímero, tal es el caso de las celulasas y xilanasas microbianas. Las aplicaciones de estas enzimas específicas con mayor potencial estarán en las industrias de papel, pulpa y agrícola industria alimentaria y en la producción de biocombustibles. Los avances en la biotecnología microbiana en las últimas décadas han construido una vía exitosa para la aplicación y valorización de residuos lignocelulósicos en la producción de enzimas más específicas y con mayor estabilidad.

PRODUCCION DE ENZIMAS LIGNOCELULITICAS POR T. harzianum

En los últimos años, una creciente preocupación ha surgido debido al gran impacto negativo sobre el medio ambiente que es provocado por los residuos lignocelulósicos ya que actualmente dichos residuos no cuentan con alguna aplicación relevante tan solo empleados para alimentación animal y/o son acumulados o descartados en depósitos sanitarios. Por tal carencia en el uso o empleo de estos materiales orgánicos, un gran número de científicos en las áreas de ingeniería de alimentos y biotecnología han estado en constante investigación, mejorando y  optimizando las condiciones de crecimiento y desarrollo del hongo Trichoderma en el proceso de FMS44, enfocándose en la valorización y el aprovechamiento de este material vegetal eliminando o disminuyendo los problemas asociados con la contaminación y principalmente para la aplicación en la producción de enzimas fúngicas con alto valor industrial (Tabla 2). En un estudio llevado a cabo por Jun y col.45 demostró la capacidad del hongo T. reesei de crecer en medio solido y producir 5.35 Unidades Internacionales (UI) por miligramo proteína de xilanasa así como 4.33 Unidades carboximetil celulosa (CMC) y 0.49 Unidades de Papel Filtro (UPF) por miligramo de proteína correspondientes a la actividad celulasa. Además, Delabona y col.15 demostraron la aplicación de los residuos de bagazo de caña de azúcar para la producción de enzimas por T. harzianum en cultivo solido obteniendo títulos de 121 UPF, 8000 UI y 1730 UI por gramo de soporte de celulasa, xilanasa y b-glucosidasa, respectivamente. Adicionalmente, en un estudio enfocado en el aprovechamiento de residuos lignocelulósicos llevado a cabo por Gómez-García y col.46 emplearon olote de maíz como única fuente de carbón para T. harzianum para la producción de xilanasa alcanzando niveles de actividad xilanolítica de 7.85 UI por gramo de soporte. Actualmente, existen diversos trabajos de investigación con respecto al uso de T. harzianum, sin embargo, muchos de ellos aún son realizados utilizando diferentes metodologías para la obtención de enzimas, tal es el caso de Li y col.47, ellos utilizaron la fermentación en medio liquido (FML) empleando rastrojo de maíz como substrato para la producción de celulasa microbiana (7.18 CMC, 0.64 UFP y 2.91 UI por mL) y Wang y col.48 también emplearon la FML combinando diferentes fuentes de carbono al medio de cultivo como aceite de palma, olote de maíz y salvado de trigo para la producción de enzimas de T. harzianum permitiendo la producción enzimática de xilanasa (185.4 UI/ mL), b-xilosidasa (5.59 UI/ mL), celulasa (72.66 CMC y 14.79 UPF/ mL) y b-glucosidasa (20.78 UI/ mL). Estas evidencias refuerzan el valor y el potencial de emplear a T. harzianum para la producción de enzimas con gran actividad biológica y además junto con la escasa información reportada involucrando la aplicación de FMS, dejan un amplio camino para la generación de futuros estudios de investigación, en los cuales se desarrollen y se optimicen mejor las condiciones de producción para obtener mayores títulos de actividad enzimática (menores tiempos y costos implementación) así como también permita el desenvolvimiento de nuevas estrategias innovadoras dirigidas a la implementación de dichas metodologías a un nivel industrial la cual permita utilizar la mayor cantidad de residuos evitando los problemas ambientales de contaminación.

Tabla 2. Espectro actual de estudios con respecto a la aplicación biotecnología de Trichoderma para la producción de enzimas lignocelulósicas.

CONCLUSIONES

Un enfoque para reducir el costo de producción de enzimas fúngicas es el uso de materiales lignocelulósicos como sustratos en lugar de celulosa pura. Hoy en día, existen estudios en las cuales está bien reportado y justificado el uso de material residual perteneciente a la agroindustria, como el rastrojo de maíz, paja de trigo, paja de arroz, bagazo y olote de maíz. La demanda de producción de estas enzimas se ha incrementado significativamente entre los diferentes cuerpos de investigación alrededor del mundo, esto debido a la gran gama de aplicaciones en diferentes áreas de la industria. La descomposición biológica de la celulosa en elementos simples permitirá la mejora de los graves problemas a mediano plazo, como los alimentos, la energía y la contaminación ambiental.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo del Programa de Fortalecimiento de la Cooperación Científica, Tecnológica y de Innovación en un Marco de Cooperación Internacional del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (C0013-2015-03-G1: 266614).

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