Influence of forced aeration and packing density on the ellagitannase production by solid-state fermentation
Díaz-Herrera, R.1, Aguilar-Zarate, P.1, Buenrostro-Figueroa, J.J.2, Prado-Barragán, A.2, Ascacio, J.A. 1 y Aguilar C.N.1*
1Grupo de Bioprocesos. Departamento de Investigación en Alimentos. Universidad Autónoma de Coahuila, Unidad Saltillo, Coahuila, México.
2Planta Piloto de Fermentaciones. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.
*E-mail: cristobal.aguilar@uadec.edu.mx
JBCT No. 23, enero-junio 2020
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Resumen
La formación de ácido elágico (AE) por fermentación en estado sólido (FES) es catalizada por la enzima elagitanasa o elagitanin-acil hidrolasa (EAH), la cual es producida por el hongo Aspergillus niger, cuya producción puede ser afectada por la selección y variación de factores en la FES. Por lo anterior, en el presente trabajo se evaluó el efecto producido por diferentes volúmenes de aireación forzada (0, 6 y 12 mL/min) y diferentes niveles de densidad de empaque (0.05, 0.06 y 0.08 g/cm3) en reactores en columna, midiendo como variable de respuesta la producción de enzima y la liberación de AE con el objetivo de establecer el comportamiento y definir las condiciones de máxima producción de enzima, liberación de producto, consumo de sustrato y crecimiento de biomasa. Se utilizaron como fuente de carbono elagitaninos (ETs) de cáscara de granada. La aireación tuvo un mayor efecto en la respuesta del proceso que la densidad de empaque. La mayor cantidad de enzima y AE se alcanzó a las 30 h (170.06 U/L y 10.9 mg/L respectivamente), demostrando que el suministro de oxígeno juega un papel importante en el crecimiento del microorganismo y en la biosíntesis de enzima requerida para la producción del agente bioactivo de interés, el AE.Palabras clave: Ácido elágico, elagitanasa, fermentación en estado sólido, aireación, densidad de empaque.
Abstract
Ellagic acid (EA) formation by solid-state fermentation (SSF) is catalyzed by the enzyme ellagitannase or ellagitannin-acyl hydrolase (EAH), which is produced by the fungus Aspergillus niger, whose production can be affected by the selection and factor variation in the FES. Therefore, the effect of different volumes of forced aeration (0, 6 and 12 mL/min) and different packing density levels (0.05, 0.06 and 0.08 g/cm3) in column reactors was evaluated, measuring the enzyme production and AE release as response variables, with the aim of establishing the behavior and defining the conditions of maximum enzyme production, product release, substrate consumption and biomass growth. Pomegranate peel ellagitannins (ETs) were used as carbon source. Aeration showed a greater effect on the process response than packing density. The highest amount of enzyme and AE was reached at 30 h of fermentation (170.06 U/L and 10.9 mg/L respectively), demonstrating that the oxygen supply plays an important role in the growth of microorganism and the enzyme biosynthesis required for the production of the bioactive agent of interest, the EA.Keywords: Ellagic acid, ellagitannase, solid-state fermentation, aeration, packing density.
INTRODUCCIÓN
El AE es una lactona que deriva de moléculas de ácido gálico y se sabe que es el residuo de la hidrólisis de ETs (Ascacio-Valdés et al., 2010). En los últimos años, el AE ha despertado un interés comercial debido a sus aplicaciones y propiedades, principalmente enfocadas a la salud humana. (Sepúlveda et al., 2011), ya que es un compuesto de alto valor utilizado en industrias tales como alimentarias, cosméticas y farmacéuticas, debido a que puede ser utilizado por sus propiedades como antioxidante, antitumoral, antiviral, antimicrobiana y anticancerígena (Buenrostro-Figueroa et al., 2014). Para que la reacción sea específica y de los ETs se pueda producir AE, se requiere la acción sinérgica de una enzima capaz de romper los enlaces químicos en los ETs monoméricos (Huang et al., 2008), como la EAH. Se cree que esta enzima de reciente descubrimiento es la responsable de catalizar la hidrólisis del grupo hexa-hidroxi difenico (HHDP) de los ETs, un intermediario para la liberación de AE. Por lo cual es necesario que se continúe con las investigaciones que ayuden a entender de manera clara cuál es la ruta de biodegradación de los ETs (Ascacio-Valdés, 2012; Sepúlveda et al., 2016).
El monitoreo y control de varios parámetros durante la fermentación son de gran importancia para lograr una alta productividad (Pandey, 2003) durante el proceso de fermentación, ya que se puede desprender una gran cantidad de calor y con el progreso de la fermentación, se produce la contracción del lecho fermentado y la porosidad disminuye, lo cual obstaculiza más la transferencia de calor. La densidad de empaque del medio puede limitar el proceso de la fermentación, dificultando la transferencia de masa y calor (Costa et al., 1998). La aireación tiene una gran importancia en la FES debido a la demanda de oxígeno en el proceso aeróbico y a los fenómenos de transporte de masa y de calor en el sistema (De la Cruz-Quiroz, 2012). La aireación del medio sólido humedecido es un factor crítico relacionado con la productividad, ya que no sólo provee oxígeno al sistema sino que también remueve el dióxido de carbono, otros metabolitos volátiles y el calor del fermentador (Lonsane et al., 1992; Saucedo-Castañeda & Trejo-Hernández, 1994)
Con la relevancia científica que ha adquirido el AE, es necesario optimizar el proceso de producción y recuperación de esta molécula, por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la adición de aireación forzada y la densidad de empaque sobre la producción de AE en FES con Aspergillus niger GH1.
Materiales y métodos
Microorganismo. Se utilizó la cepa Aspergillus niger GH1 de la colección de microorganismos del Departamento de Investigación en Alimentos (DIA) de la Universidad Autónoma de Coahuila. La cepa se activó en matraces con medio PDA durante 120 h, a 30 °C, se preparó una suspensión de esporas a 50 mL de una solución Tween 80 al 0.1 % y se contó el número de esporas en la cámara de Neubauer.
Sustrato. Se trabajó con polifenoles totales de granada (PTG), los cuales fueron proporcionados por el Departamento de Investigación en Alimentos (DIA), la purificación se llevó a cabo por el método propuesto por Ascacio-Valdés et al en 2013. Las fracciones polifenólicas se sometieron a una separación utilizando cromatografía de alta resolución en escala preparativa en un equipo de cromatografía liquida (Varian ProStar 3300, Varian, USA) equipado con una columna Dynamax, Microsorb 300 C18 (250 mm x 21.4 mm, 10 µm), se utilizó un flujo de 5 mL/min y las condiciones fueron: como fase móvil: A) CH3COOH (3 % v/v en agua) y B) acetonitrilo. Después se dejó evaporar el solvente durante 24 h a 50 °C, se recuperaron los polifenoles en forma de polvo y se almacenaron en frascos ámbar para protegerlos de la luz.
Las fracciones obtenidas se sometieron a un análisis de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) escala analítica acoplado a masas para la cuantificación de ETs obtenidos del proceso de extracción de los PTG. Para lo cual las muestras previamente filtradas (membrana 0.45 µm) se sometieron al análisis en un equipo ProStar 3300, Varian, USA, con una columna analítica Grace Denali C18 (250 mm x 4.6 mm, 5µ), con un flujo de 1.4 mL/min utilizando como solventes CH3COOH (3%) y acetonitrilo.
Fermentación en estado sólido. La fermentación se llevó a cabo con la metodología propuesta por Buenrostro-Figueroa et al. (2014), utilizando espuma de poliuretano como soporte inerte. La espuma se redujo a un tamaño de partícula de 0.250–1.19 mm en un molino Pulvex®, se lavó varias veces, se dejó secar a 60 °C por 2 d. Los reactores que se utilizaron fueron columnas de 2.25 x 18 cm, la espuma de poliuretano se impregnó a un 70 % de humedad, es decir, 6 g de PUF húmedo en cada reactor (1.8 g de PUF seco más 4.2 mL de medio con ETs), se prepararon 59.5 mL de medio de cultivo el cual contenía: 38.5 mL de medio de cultivo Czapek-Dox modificado por De la Cruz en el 2012 (elagitaninos: 7.5 g/L, nitrato de sodio: 3 g/L, fosfato de potasio dibásico: 1 g/L, sulfato de magnesio: 0.5 g/L, cloruro de potasio: 0.5 g/L), 20 mL de ETs (0.44 g) y 1 mL de suspensión de esporas con una concentración de 2 x 107 esporas/g de espuma, se homogeneizó la mezcla y se empacó en los reactores. La fermentación se realizó a una temperatura de 30 °C por 18 h (De la Cruz-Quiroz, 2012). Una vez finalizada para obtener los extractos enzimáticos a las muestras se les añadió 10 mL de búfer de citratos 50 mm (pH 5) se homogeneizó y se filtró por medio de jeringas estériles con algodón y papel filtro, los extractos filtrados se utilizaron para las determinaciones analíticas deseadas.
Los resultados de la fermentación fueron evaluados a las mejores condiciones de aireación y densidad de empaque determinadas previamente. La fermentación se realizó como fue descrito en el apartado anterior, se realizó una cinética en la que se tomaron muestras cada 6 h en un periodo de 36 h a 30 °C por duplicado, posteriormente se analizó biomasa, consumo de sustrato, actividad elagitanasa y producción de AE.
Ensayo de actividad elagitanasa. Para evaluar la actividad enzimática se utilizó como sustrato ETs de cáscara de granada. Se usó un control compuesto por 1 mL de solución amortiguadora de citratos y 50 µL de extracto enzimático. La mezcla de reacción contenía 1 mL de ETs (1 mg/mL) más 50 µL de extracto enzimático. La reacción se realizó a 60 ºC en baño de agua durante 10 minutos, finalizado el tiempo de reacción, se agregaron 1.5 mL de etanol absoluto para detener la reacción. Las muestras se sonicaron por 25 minutos, se filtraron a través de una membrana de 0.45 µm de diámetro y se almacenaron en viales para la cuantificación de AE.
La cuantificación de AE se llevó a cabo por HPLC (Varian ProStar System) con un detector de matriz (PDA ProStar) a 254 nm, de acuerdo con Ascacio-Valdés et al. (2013), bajo las siguientes condiciones: una columna Optisil ODS (5µm, 250 x 4.6 mm), flujo de 1 (mL/min), y un volumen de muestra de 10 mL, en columna por 40 minutos, con una fase móvil que consistió en metanol, acetonitrilo y ácido acético al 3%, se preparó una solución de AE para la curva de calibración. Una unidad elagitanasa se definió como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µmol de AE por minuto por mL de extracto enzimático bajo las condiciones descritas.
Determinaciones analíticas. El consumo de sustrato se midió por HPLC en un equipo marca Varian®, para determinar la cantidad de sustrato (punicalina) presente en cada muestra (KUA) a lo largo de las 36 h de fermentación.
La biomasa se determinó por el método indirecto de glucosamina. Las muestras fueron hidrolizadas para liberar la glucosamina de la pared celular; el compuesto pirrol formado cuando es combinado con acetilacetona reacciona con p-dimetilaminobenzaldehído, formando un compuesto rojo. Se llevó a cabo una curva de calibración de glucosamina bajo las mismas condiciones experimentales usadas para las muestras. La glucosamina asociada al crecimiento microbiano se determinó para obtener el contenido de biomasa (mg/g) de muestra (Medina-Morales et al., 2012).
Diseño experimental y análisis estadístico. Se evaluó el efecto de la aireación y la densidad de empaque a tiempo final y se evaluó con un diseño experimental completamente al azar 3×3, los tratamientos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Diseño utilizado para la evaluación de la aireación y la densidad de empaque en la producción de AE
El flujo de aire fue controlado mediante válvulas y los diferentes niveles de densidad de empaque se alcanzaron comprimiendo el material inoculado a varias alturas, los resultados fueron analizados en el programa STATISTICA 7.
Resultados y Discusión
Los resultados de los nueve tratamientos para la producción de la enzima y la liberacion de AE en reactores en columna se muestran en la Tabla 2, donde se obtuvo tanto la mayor actividad enzimática como la mayor acumulación de AE en el tratamiento 9 (flujo de aire de 12 mL/min y densidad de empaque de 0.05 g/cm3), mostrando un valor de 259.7 U/L de la enzima y 9.7 mg/L de AE.
Tabla 2. Resultados de la fermentacion a las 18 h para los 9 tratamientos evaluando la producción de enzima EAH y la liberacion de AE.
Por lo anterior, se realizó una análisis estadístico para determinar si los factores de aireacion y densidad de empaque tienen algún efecto sobre la producción de la enzima EAH. En la Figura 1 se muestra un diagrama de Pareto donde se muestra el efecto de los factores evaluados y su interacción, y se observa que sólo la aireacion en valores altos tuvo un efecto significativo por encima de la densidad de empaque y su intercacción.
Sin embargo, el análisis de varianza realizado (p 0.05) para evaluar los factores para la liberación de ácido elágico evidenció que ningún factor ni su interacción influyen sobre su acumulación, lo cual indica que la cantidad de AE liberada no está directamente relacionada con la cantidad de enzima producida, esto puede ser debido a la heterogeneidad del medio de cultivo en la fermentación.
Con base en estos resultados obtenidos, en la Figura 2 se observan los resultados de la cinética que se realizó durante 36 h tomando muestra cada 6 h para monitorear el comportamiento de la enzima, el consumo de sustrato y la producción de biomasa utilizando la mayor cantidad de flujo de aire de 12 mL/min y el valor más bajo de densidad de empaque (0.05 g/cm3), esto para favorecer el transporte de oxígeno y el crecimiento del microorganismo. En la producción de la enzima elagitanasa y la liberación de AE, el mayor efecto se debe a la aireación de la fermentación. También se encontró que de todos los tratamientos, uno presentó los mejores resultados (tratamiento 9), con un flujo de aireación de 12 mL/min y una densidad de empaque de 0.05 g/cm3, posiblemente debido a que fue de los tratamientos con mayor aireacion en el sistema, teniendo similitud en los resultados con los demás tratamientos, sugiriendo que la aireación es un factor importante para la producción de enzima y AE.
Los resultados de la cinética mostraron una caída en la producción de enzima casi del 35 % en relación con los valores obtenidos en la primera fermentación donde el valor máximo de enzima fue de 259.7 U/L a las 18 h, cuando en la cinética el valor máximo es de 170.06 U/L. Esto puede ser debido a factores como la temperatura, el ambiente, la presión, entre otros.
Sin embargo, los valores en los tratamientos son mayores a los reportados por Ascacio-Valdés en el 2013, donde reportan una máxima actividad elagitanasa de 200.04 U/L en FES a las 12 h de cultivo con A. niger GH1 y ETs de cáscara de granada como sustrato. Aguilera-Carbo et al. (2009) reportaron una producción de 44.5 U/L a las 36 h utilizando ETs de hoja de gobernadora como sustrato; tal producción es menor a lo obtenido en este estudio tanto en la primera como en la segunda fermentación.
En cuanto a la producción de AE se logró un aumento casi del 13% probablemente debido a la mejor interacción de la enzima con el sustrato en el medio con respecto a lo obtenido en la medición de los tratamientos donde se tenía un valor máximo de 9.68 mg/L y en la cinética se alcanzó un valor de 10.9 mg/L de extracto a las 30 h. Los resultados obtenidos son mayores a lo reportado por Robledo et al. (2008) donde reportaron 6.3 mg/g de AE a las 144 h de cultivo utilizando como sustrato polifenoles de granada con A. niger GH1 en FES. No obstante, el valor máximo de AE obtenido en este estudio (10.9 mg/L) es 3.85 veces menor al reportado por Ascacio-Valdés en el 2013 a las 12 h de cultivo, empleando un extracto parcialmente purificado de ETs de cáscara de granada.
Se observó un comportamiento similar tanto en la producción de enzima como de AE, observando un aumento a las 6 h y disminuyendo a las 12 h. Lo anterior se puede deber al comportamiento mostrado por el microorganismo en función del consumo de sustrato, el cual alcanza su máximo a las 10 h, ya que el primer compuesto en la fermentación es la punicalagina, el cual se cree se degrada a punicalina según la gráfica en un tiempo de entre las 6 y las 12 h. Por este motivo el crecimiento del microorganismo disminuye para las 12 h y vuelve a incrementar a las 18 h, mismo tiempo en que la punicalina empieza a funcionar como sustrato; por lo anterior, el crecimiento del hongo se debe a la utilización de otros ETs presentes en el medio hasta poder utilizar la punicalina como sustrato. El máximo crecimiento (30 h) corresponde al valor más bajo de punicalina (0.25 mg/g), lo cual tiene relación con la máxima producción tanto de AE como de la enzima EAH.
CONCLUSIÓN
Estos resultados indican que las condiciones establecidas presentan un buen rendimiento tanto para la producción de elagitanasa y ácido elágico como para el crecimiento del microorganismo, ya que solo el primer parámetro aumentó en función con la aireación forzada pero al ser un medio heterogéneo no se dio una buena interacción de la enzima con los Ets. Sin embargo, se debe seguir investigando para poder encontrar las mejores condiciones de cultivo, para asi optimizar el proceso y mejorear el rendimiento, resultando asi una alternativa viable para la produccion de estos compuestos.
Agradecimientos
El autor Díaz-Herrera agradece a la Universidad Autónoma de Coahuila en Saltillo y a la Universidad Autónoma Metropolitana unidad Iztapalapa por el apoyo brindado durante la realización de este trabajo.
Conflicto de interés
Los autores declaran que no existe conflicto de interés.
REFERENCIAS
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